10.Phage DNA の精製 －プレート・ライセート法 （魚住尚紀）
Phage DNAの回収・精製には、液体培地を用いる方法と、ここに記したプレート・ライセート法がある。プレート・ライセート法は手数がかかるのが欠点だが、確実で失敗が少ない方法である。最終段階のPhOH/Chl抽出とエタノール沈殿の回数は数を決めてやるよりも、界面、沈殿の様子を見て適宜判断するのがよい。消化する制限酵素によって必要とされる精製度も違ってきます。
１．用意するもの
diluent 10 mM Tris-HCl pH 7.5
10 mM MgSO4
PEG液 5 mM Tris-HCl pH 7.5
10 % PEG6000 (100 g/l)
1 M NaCl (58 g/l)
5 mM MgSO4･7H2O (1.23 g/l)
２．手順
培養
トップアガーには必ずアガロースを用いる。アガーには阻害物質が含まれているらしく、回収したDNAの制限酵素での消化が悪くなる。
15 cm × 9 cm 角プレートにファージを感染させた大腸菌を播き、一晩培養して全面溶菌させる。プレートは新しいものを使い、湿度を高く保つため、ぬらしたキムタオルとともに袋に入れ、正立させて培養するのがよい。
ファージ粒子回収
プレートにdiluent 12 mlをはり、クロロホルムを数滴たらして、室温90min. 震盪し、得られるファージ懸濁液を50 mlチューブに移す。
プレートにdiluent ４mlを入れ、洗いこんで懸濁液に合わせる。
４℃､10,000 × g､10 min. 遠心し、デブリスを除く。(上清を新しいチューブに移す）
RNase 10 μg, DNaseI 10 μg 加え、37 ℃, 10 min. 反応させて大腸菌由来の核酸を分解させる。
PEG液を15 ml加え、２時間放置する(on ice)。
４℃､10,000 × g､10 min. 遠心し、上清を完全に除く。
沈殿を１ ml diluentに懸濁し、エッペンチューブに移す。
４℃､12,000rpm､10 min. 遠心し不溶物を除く。
上清を15 mlチューブに移し、RNase 2 μg 加え、室温10 min. 放置。
ファージ粒子破壊
0.5 M EDTA 50μl, 10 % SDS 30 μl 加え、65 ℃, 25 min. 放置。
ファージDNA回収
1 ml PhOH/Chl 加え、よくvortexしてから遠心。上層回収する。
PhOH/Chl 抽出を数回繰り返す。（中間層が見えなくなるまで）
1 ml 5M NH4OAc を加え、エタノール沈殿する。
沈殿を200 μl TEに溶解し、200 μl 5M NH4OAc を加え、on ice 30 min. 放置。４℃､10,000 × g､10 min. 遠心し、透明なゲル状沈殿をとらないように上清を1.5 ml チューブに移す。
800 μl エタノール加え、エタノール沈殿する。
エタノール沈殿を数回繰り返す。（DNAの沈殿の濁りがとれるまで）
参考：遺伝子工学の基礎技術 pp.45-48 (バイオマニュアルシリーズ、羊土社)