6.プローブ標識法（尾藤晴彦）
DNA断片の標識は、応用範囲が広いため様々なvariationが開発され、protocolは多種多様である。以下では、最も多用されると思われる手法についてのみ述べる。現在では、ほとんどのmethodがいずれかのメーカーによってキット化されている。
１．random primerを用いたmultilabelling
用途： DNA、RNAのhybridization
原理： random 6-merまたは9-merをprimerとして反応させ、[α-32P]-dCTPをincorporateしたDNA断片をKlenow fragmentまたはT7 DNA Polymeraseによって合成する。
コメント： 短時間で高比活性のプローブが得られるが、cold templateが必ず残るので、hybridizationの条件によってはbackgroundが高くなったり、bandがsmearを引く原因となるといわれている。
現実的には、Klenowを用いた場合、約200-300bpを中心とする短い長さのprobeが多くできる。T7 DNA Polymeraseではもう少し長いprobeも出来る。random 6-merを使う場合は、 30minの反応で、random 9-merの時は5minの反応で＞109cpm/μgの効率でラベルできるとされている。
kit: Amersham： random 6-mer + Klenow(Multiprime kit)
Stratagene: random 9-mer + Klenow (Flash Prime It kit)
Pharmacia: random 9-mer + T7 DNA Polymerase (T7 Quick Prime kit)
コストパフォーマンスではPharmaciaのキットが現在ではbest(公称1-2 x 109 cpm/μg)。
materials：
5x labelling buffer : 250 mM Tris, pH 8.0
25 mM MgCl2
10 mM DTT
1 mM HEPES, pH 6.6
26 OD260/ml random 6-mer (Pharmacia) (i.e. 約1μg/μl conc.)
nonlabeled dNTPs : 500μM dATP,500μM dGTP,500μM dTTP
nuclease free acetylated BSA: 10 mg/ml
[α-32P]-dCTP : 10μCi/μl, 3000Ci/mmol
Klenow fragment (Takara)
method: 1. heat-denature template DNA 25 ng (in 30μl) at 95-100℃ for 5 min. chill very quickly on ice-water.
2. mix as follows:
5 x labelling buffer: 10μl
template DNA sol. : 30μl
nonlabeled dNTPs : 2μl (final 20μM each)
BSA : 2μl (final 400μg/ml)
labeled dCTP : 5μl (final 333 nM)
Klenow enzyme : 1μl (5 units or 100 u/ ml)
3. reaction at 25℃, 60-120 min.
4. stop reaction by adding 2μl of 0.5 M EDTA (final 20 mM).
２．Riboprobe
用途： DNA、RNAのhybridization、in situ hybridization
原理： SP6、T7、T3 promotorを持つvectorのinsertを鋳型として、SP6 RNA Polymerase,T7 RNA Polymerase, T3 RNA Polymeraseによって、[α-32P]-CTPをincorporateしたcRNA probeをin vitro合成する。
コメント： 高比活性のprobeが得られ、しかもtemplateをDNase処理してしまうので、backgroundが低く、バンドがsharp。しかし、酵素が高価で失活しやすいことやfull insertを用いるとprobeの長さが数kbとなってしまうのでアルカリ処理による断片化が必要なことなどから、条件検討が面倒である欠点がある。
kit : Stratageneの酵素、Stratagene、Promegaのlabelling kitが良く用いられている。
materials： 5 x transcription buffer :
200 mM Tris pH 7.5
30 mM MgCl2
10 mM spermine
50 mM NaCl
nonlabeled NTPs: 2.5 mM ATP, 2.5 mM GTP,2.5 mM UTP(pH 7.0)
[α-32P]-CTP (NEN NEG-008C10) : 40μCi/μl, 800 Ci/mmol, 37 MBq
RNAse inhibitor (Takara)
SP6 RNA Polymerase, T3 RNA Polymerase, T7 RNA Polymerase (Stratagene)
10 x hydrolysis buffer : 0.4 M NaHCO3, 0.6 M Na2CO3, pH 10.2
method:
1. linearize DNA template with an adequate restriction enzyme, and prepare template in an RNAse-free way.
2. Mix as follows (at room temperature to avoid precipitation of DNA with spermine):
5 x transcription buffer : 4μl
100 mM DTT : 2μl
RNase inhibitor : 1μl
nonlabeled NTPs : 4μl (final 500μM each )
linearized DNA template (1μg/μl) : 1μl
[α-32P]-CTP : 7μl (final 17.5μM)
RNA Polymerase : 1μl
total : 20μl
3. incubate at 37℃ for 60 min.
4. Add DNase I (Pharmacia) 1μl, at 37℃ for 10 min.
5. phenol-chloroform extraction/ EtOH precipitation with NH4OAc.
6. redissolve in DDW 45μl.
7. Alkali treatment: add 5μl 10 x hydrolysis buffer reaction at 60℃ for t min where t= (S-E)/ (0.11 x S x E):
S: starting length (bp), E: ending length (bp)
8. stop on ice and by EtOH precipitation
３．Nick translation法
用途： DNA hybridization
原理： DNase Iによってnickの入った ds-DNAに DNA Polymerase Iを用いた修復過程で32Ｐのincorporationを行う。
コメント： 比活性の点では上記２法に劣るが、template DNAに直接Ｐが取り込まれる特徴があり、cold templateによる阻害がない。得られるprobeサイズが一定しているのである種の条件検討には適している。また量的に多量のプローブﾞが一時にできる。DNase I/ DNA Pol I mixtureの調製が難しい。
kit: Amersham、Promegaより
materials： 10 x Nick translation buffer:
500 mM Tris pH 7.2
100 mM MgCl2
1 mM DTT
unlabeled dNTPs: 100μM dATP,100μM dGTP,100μM dTTP
[α-32P]-dCTP : 10μCi/μl, 3000Ci/mmol
enzyme mix : 0.5 units DNA Pol I/μl
10 pg DNase I/μl
stop solution: : 0.2 M EDTA pH 8.0
method:
1. Mix as follows on ice :
unlabeled dNTPs : 20μl ( final 20μM each )
10 x buffer : 10μl
sample DNA : 1μg
[α-32P]-dCTP : 20μl
DDW : 40μl
enzyme mix : 10μl
total : 100μl
2. incubate at 15℃ for 60 - 120 min.
3. stop by adding 10μl of stop solution.
４．oligonucleotide labelling
A. 3'-end labelling with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)
コメント：oligoの3'-端に[α-32P]-dATPを"tail"としてくっつける方法である。hybridizationのprobeとして使用する際には、何個のdATPがtailとしてincorporateされたかをきちんとモニターしないと、hybridizationのstringencyが決められない。[α-32P]-cordicepin-5'-trisphosphate (NEN NEG-026-10)を用いた場合は、1 baseのtailの添加で反応が終結してしまう利点がある。
kit: Promegaのkit（DNA 3'-end Labelling System)が優れている。
materials: 5 x TdT buffer:
500 mM cacodylate pH 6.8
1 mM CoCl2
0.5 mM DTT
500μg/ml BSA
[α-32P]-dATP :10μCi/μl, 800 Ci/mmol
[α-32P]-cordycepin-5'-triphosphate: 10μCi/μl, 5000 Ci/mmol
TdT : 単品で買うならBRLのbuffer付きが良い。
method1:
1. Mix as follows:
5 x TdT buffer : 4μl
primer DNA : 2 pmol
[α-32P]-dATP : 1.6μl
TdT : 10-20 units
total vol. : 20μl
2. incubate at 37℃ for 30 - 60 min.
3. stop by heating at 70℃ for 10 min.
method 2:
1. Mix as follows:
5 x TdT buffer : 10μl
primer DNA : 10 pmol
[α-32P]-cordycepin-5'-triphosphate: 7.5-10μl
TdT : 20-40 units
total vol. : 50μl
2. incubate at 37℃ for 30 min.
3. stop by heating at 70℃ for 10 min.
In either case, check P-incorporation by DE81 filter binding and tail size by PAGE.
B. 5'-end labelling with T4 polynucleotide kinase
原理：ヒドロキシル化されたまたは脱リン酸化されたDNA5'端へT4PKにて[ γ-32P]-ATPを取り込ませる。合成オリゴはすべて5'が脱リン酸化されたままなので、直接T4PKにてラベル可能である。
kit: PromegaのDNA 5'-end Labelling Systemが優れている。
material: 10 x T4PK buffer :
500 mM Tris pH 7.5
100 mM MgCl2
50 mM DTT
1 mM spermidine
[γ-32P]-ATP: 3000 Ci/ mmol, 10μCi/μl
method:
1.Mix as follows:
oligonucleotide(100 ng): 5μl
[γ-32P]-ATP : 3μl
10 x T4PK buffer : 1μl
T4PK : 1μl
total volume :10μl
2. incubate at 37℃ for 10 min.
3. stop by adding 1μl of 0.5 M EDTA.
５．標識DNAの精製
DNAのラベル反応には必ずfreeのDNAの残存がある。標識されたDNAをprobeとして、s/n比を高めるためには、freeのDNAをカラム法にて除去する必要がある。通常当教室では、各自自製のspin column（ｸﾞﾗｽｳｰﾙの上にSephadex G-25をapplyしたもの）、またはPharmaciaのNick columnを用いてfree labelを除去している。前者は、volumeが増えない代わり、調製が面倒な点、後者は final volumeが300-500μlになる欠点がある。