12.IAP（百日咳毒素）によるADPリボシル化法（坂中千恵）
1) IAP stock solution stock 400μg/ml, tore at 4oC(Don't freeze!) for several months
obtained from フナコシ（freeze dried /store at -20oC) catalog No. KK0002-00
50μg/1bottle x 4(=ｴ50,000)
50μg of IAP dissolved in 37.5μl of water, 62.5μl of 4M urea, 25μl of 50mM Tris-HCl(pH8.0)
2) intact cell
10ng～100ng/ml in culture medium(with 0.1% BSA or 10% FCS)
4hr～24hr incubate at 37℃
3) membrane
a)reaction mixture(for 10 assay)
1M Tris-HCl(pH8.0) 50μl(final 50mM)
0.1M Thymidine 50μl(final 5mM)
100mM ATP 10μl(final 1mM)
0.5M EDTA 2μl(final 1mM)
0.5mM NAD 10μl(final 5μM)
1M DTT 1μl(final 1mM)
water up to 700μl
b)NAD solution(hot!!)
[ 32P ]NAD (NEN, NEG-023X10, 9.25MBq,5mCi/ml)
x25 dilute with water
c)activate IAP
IAP stock solution(1)) 10μl
+water 3μl
+4M urea 5μl
+50mM Tris-HCl(pH8.0) 2μl
+100mM ATP 0.4μl
+100mM DTT 0.4μl
→incubate at 30℃ for 30 min
d)assay
sample(membrane) 10μl(5～20μg)
+reaction mixture(a) 70μl
+NAD solution(b) 10μl
+activated IAP(c) 10μl
→incubate at 30℃ for 30 min
e)stop reaction
for SDS-PAGE
assay mixture 100μl
+500μl of 12% TCA
→on ice for 12hr～
→centrifuge 15,000rpm for 20min
discard sup.
ppt. dissolved in SDS-PAGE sample loading buffer
(!!pH should be adjusted at 7.5～8.0)
付）
1.無傷細胞の場合、10ng/ml、24時間の処理でほとんどすべてのIAP基質がリボシル化されると考えられる。高濃度（mgオーダー）の処理は細胞刺激作用が問題になるといわれているので注意が必要である。
2.NADase活性の強い細胞、膜の場合（HL60など）は上記の条件でうまくリボシル化されないことがあるらしい。NADase活性を抑制するためINH、ADPリボースを加えるなどの工夫が必要となる。CHO、COS細胞は上記の方法でうまく行く。
3.SDS-PAGEを行った場合には、毒素のAプロトマー（28K）のリボシル化されたバンドが見られる。
4.TCAで蛋白を沈殿させたあとSDS-PAGEバッファーに溶かすときには必ずpHが中性付近（BPBの色が青くなる）になるようにする
（2Mのtrisを使うと合わせやすい）。