9.Western blotting（和泉孝志）
１.はじめに
通常ＳＤＳーＰＡＧＥ後、メンブレンフィルターに吸着させたタンパク質を特異抗体を用いて検出する方法である。ブロッティング方法として(1)水槽型、(2)セミドライ型があるが、ここでは操作が簡単で速いセミドライ型について述べる。検出方法としては、２次抗体の種類によって、(1)AP(アルカリフォスファターゼ)法、(2)HRP(Horse Radish Peroxidase)法、(3)125I-Protein A法（抗体ではない、高感度）などがあるが、ここでは操作が簡単で基質の安全性の高いAP法について述べる。
２.用意するもの
Ａ.泳動のすんだＳＤＳーＰＡＧＥゲル
泳動時に Rainbow Marker (Amersham RPN756) 5μlを同時に流しておくとマーカーとして、またブロティング効率の推定のために便利。
myosin 200 KD blue
phosphorylase b 92.5 KD brown
BSA 69 KD red
Ovalbumin 46 KD yellow
carbonic anhydrase 30 KD orange
trypsis inhibitor 21.5 KD green
lysozyme 14.3 KD magenta
Ｂ.メンブレン 1.ニトロセルロース（Amersham Hybond C 0.45 μetc.）
操作が簡単でブロッキングも短くてよいが泳動しすぎる危険がある。バックがきれい。
２.ＰＶＤＦメンブレン（BIO-RAD etc）
主にシークエンス用、ブロッキングを長くする必要あり。泳動しすぎる危険はない。バックの発色あり。
メタノール（数秒）、転写液（１５分）にて湿しておく必要がある。その後乾かしてはいけない。
ここでは１について述べる。
Ｃ.泳動液 100ml
10 x Tris-Glysin 10 ml (10x, 1l = 30 g Tris, 144 g Glysin)
メタノール 20 ml
水 70 ml
10 % SDS 0.2 ml
（混合後３分ソニケート、長くしすぎると塩が析出する）
Ｄ.ブロッキング液 (FCS 10-20%, BSA 1%, OVA 1%, or Skim Milk 0.5%)
Skim Milk が手軽で安い。ブロックエース(雪印製、大日本製薬)として市販。
Ｅ.TBS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl)
Ｆ.T-TBS (TBS + 0.1 % Tween 20)
Ｅ、Ｆは洗浄瓶に入れておくと便利 (Stock: 20 x TBS, 10% Tween 20)
Ｇ.AP反応液（100 mM Tris-HCl pH 9.5, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl）
Ｈ.100 x AP基質液(a. NBT 50 mg/ml 70% dimethylformamide, b. BCIP 50 mg/ml dimethylformamide) 10 ml反応液にa液66μl,b液33μlを混ぜる。
（Ｇ、ＨはBIOｰRADからKitとして販売されている。）
Ｉ.一次抗体液：Monoclonal Ab (1-5 μg/ml) Polyclonal Ab (100-1000 倍希釈)
titrationの必要あり。Monoclonal Abの場合 Culture Sup. をそのまま使用できることもある。希釈する場合はTBSBSA(1%)などで行う。NaN30.02%を入れておけば4℃保存で10回以上使用可能。
Ｊ.AP標識二次抗体液。抗マウスヒツジ抗体、抗ウサギヒツジ抗体など。
市販。500-3000倍希釈。TBSBSAやTBS+1/10ブロックエースで希釈。
Ｋ.Whatmann 3M paper
Ｌ.ブロティング装置
３.手順
Ａ.ブロティング
1)ゲルの大きさに切ったＢ、Ｋ(４枚)を用意し、ゲルとともにＣにつけ３分振る。
2)図のように下から順番に気泡に注意しながらのせる。
3)最後に重い本（生化学辞典、シグマのカタログなどが重宝）を上におく。
4)200 mA(定電流)30-60分転写
(10%ポリアクリルアミドゲルの場合、目的タンパク質の分子量にもよる)
5)メンブレンをTBSで洗う。ゲルは確認のために染色する。
Ｂ.抗体による検出
以後の操作は室温でのshakerによる震盪である。
1)ブロッキング。Ｄ液,15分
2)TBS,5分２回
3)一次抗体,1-2時間。または４℃ over night。
4)TBST,5分。TBS,５分２回。（一次抗体は回収して再使用）
5)２次抗体,30分-1時間
6)TBST,5分。TBS,５分3回。
7)AP反応液に基質を加えメンブレンを浸す。
8)発色してきたら(5-15分)、水でよく洗い、ろ紙上で乾かす。
9)光を避けろ紙にはりサランラップでカバーして保存する。